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美国环保署对苏云金芽孢杆菌的登记管理要求伟

     
     
     作者:李敏 、傅桂平、任 晓 东、 吕 宁、 林荣 华、宗伏 霖
     Bt是一种土壤中普遍存在的自然发生的微生物,1901年由日本人Ishiwata在家蚕细菌病研究中首次发现?1915年德国科学家Berliner发现类似杀灭粉蛾幼虫的杆菌,并将它正式命名为苏云金芽抱杆菌?20世纪30年代,法国研究人员开发生产出第一个商业化的Bt产品?1961年Bt在美国首次作为杀虫剂登记使用?1 产品介绍
     
1.1 生物特性Bt属细菌界,厚/硬壁菌门,芽孢杆菌纲,芽孢杆菌目,芽孢杆菌科,芽孢杆菌属,蜡状芽胞杆菌组,苏云金芽孢杆菌种,是一种分布极广的?在其生活史中能形成芽孢和产生伴胞晶体的需氧革兰氏阳性杆菌?伴胞晶体主要由一种或多种蛋白质组成,也被称为5-内毒素?伴胞晶体对某些无脊椎动物,尤其是对鞘翅目?双翅目和鱗翅目昆虫有毒,其毒性具有菌株特异性?1.2 登记使用情况1.2.1 防治对象和使用方法Bt产品防治对象有:鞘翅目,双翅目和鱗翅目昆虫?主要登记剂型有:悬浮剂?饵剂?乳油?悬乳剂?颗粒剂?水分散性粒剂和可湿性粉剂?施药方法有手动喷雾?低/超低容量喷雾及空中施药等?1.2.2登记产品及分类
     目前,EPA登记了属于5个亚种的Bt产品,每个亚种具有一个或多个菌株,这5个亚种分别是:以色列亚种?库斯塔克亚种?站泽亚种?拟布甲亚种和错螺亚种,登记产品及分类?表1 EPA登记的Bt亚种和菌株
     


     EPA曾经将同一亚种的所有Bt菌株分配在同一电脑编码下?因为已知S-内毒素基因一般驻留在可转移的遗传元件中,无论属于哪个亚种,都可以轻易地从一个菌株移动到另一个;基因工程技术也允许编码内毒素杀虫蛋白的遗传物质在亚种间转移,目前EPA不再使用亚种分类单位作为Bt主要区分特征?1989年后,EPA对Bt菌株都是按单一有效成分登记的?通过将Bt相关遗传序列插入其他细菌或植物,产生5内毒素的产品已经被分开登记?2 登记资料要求
     
2.1 产品化学伟德国际官网网址
     《美国联邦法规》是美国联邦政府执行机构和部门在《联邦公报》中发表与公布的一般性和永久性规则的集成,具有普遍适用性和法律效应?CFR第40部分,158.2120节规定了微生物农药产品分析资料要求,包括产品特性和组成?分析方法及含量限量?理化性质3个部分?EPA对微生物农药产品分析资料要求与传统化学农药平行?然而由于微生物农药独特的性质?组成和作用模式,又有一些重要差异?例如,应该通过分类地位?血清型和菌株,或任何其他适当的方法尽可能识别原生动物?细菌?真菌和病毒?这些信息将取代传统化学农药的化学名称和结构信息?表2微生物农药登记产品分析资料要求
     


     表格说明:I.对微生物农药每一个分离菌株都有此要求?分离菌必须有协议存储在相关单位,以保证样品在登记期间不被丢弃?2.对支持每一个母药和制剂产品登记都要求?该分析必须在生产过程中不会有微生物污染或微生物再生之后的时间点进行?对于完整的登记,一般来说样品分析是一段时间内各批次的汇编?3.仅对乳状液体微生物农药要求?4.当微生物农药用金属?塑料和纸质包装时需要?5.液态微生物农药要求此项?2.1.1 产品特性A.微生物农药的特性,应尽可能包括:分类地位?血清型?菌株或任何其他适当的命名?应提供用于精确识别的试验程序和标准,血清,或其他识别方式及这些试验的结果?如果微生物农药含有参与杀虫活性?致病性?毒性等的质粒或其他染色体外遗传物质,这些以及由这些原件编码的任何已知表型性状和其稳定性都必须被识别?野生型或基因改变的菌株是否被认为是一种新的活性成分将在个案的基础上,通过与现有相关菌株做比较而决定?通用名,别名和被取代的名字?生物的自然发生,它与其他物种的关系,以及它的历史?对微生物农药形态类型的描述,和该生物任何不寻常的形态?生化或抗性特点?以认可的效力单位表示的产品中存在的有效成分重量百分比,每单位重量或单位体积产品中有效成分的量?有效成分的靶标物种,害虫宿主范围,生命周期和作用模式方面的生物特性?考虑微生物农药的性质,任何对哺乳动物?环境和非靶标物种已知的或潜在的危害都应该被讨论?如果微生物农药基因已经改变,用于微生物基因改变的方法也应提供?B.除微生物农药外,已知存在的或在农药产品中可能被合理鉴别出的每个成分的登记申请应包括以下信息:各成分的百分组成;单位体积或重量产品中的微生物杂质数量;单位体积或重量产品中菌落形成单位等生存资料?该成分是否为有效成分,或故意添加的成分或杂质?化学文摘索引命名中的化学名称或其他定义明确的名称?如果一个或更多杂质属微生物药剂,应根据可接受的命名系统来分类/识别药剂?化学文摘注册号?产品名称,商标名和通用名?试验或内部代码号?微生物农药之外的每个有效成分经验配方?分子量或分子量范围?结构式?要求限量认证的每个成分的组成限2.1.2 生产工艺A.所需信息,每个母药或制剂产品的登记申请应该包括基本的制造工艺描述?应列出初始和中间材料及为确保这些材料完整所采取的步骤,以及在未配方微生物农药制剂中,限制外来污染的措施?该描述应该包括制造商建立的,用来生产未配方微生物农药的培养物的特征和纯度识别程序?制造方法和保障产品统一或标准化的技术?由特定和敏感的化学?血清学或生物试验所确定的产品的完整性需要表明?如果该测试不是公认的标准测试,必须提供测试的详细描述,及有关精度,特异性,干扰物质,准确性和灵敏度的信息?B.样品保存?登记的微生物农药样本要保存于国家公认的菌种保藏中心?大的初始批量可作为后续批次的种子储备,分为小份保存?这将减少通过系列途径引起的污染和变异?如果微生物农药产生毒素,可能需要作为一种质控指标进行监控?2.1.3 在国家认可的菌种保存机构存储样品A.背景?1984年微生物农药的原始数据要求里包含一项条件性的规定,提交微生物农药样本到EPA马里兰州储藏室的要求?EPA很快认识到自己的农药储藏室没有特殊的设备和专业知识来妥善保存这些活的生物?直到2007年CFR第158部分生化和微生物农药资料要求被修订和出版时,提交样本的资料要求才被在国家认可的菌种保存机构储存样品所替换?由于微生物获得或失去杀虫性能活性,或由于突变或由于遗传物质自然转移或损失而获得其他风险因素的潜力,独特识别每一个微生可的菌种保存机构储存样品所替换?成分的组成限u]?度的信息?可能需要作为一种质控指标进行监测?左药管埴PesticideScienceandAdministration2017,38不能实现,那么必须划定可接受的平均控制污染物水平?B.有毒或致敏物质?如果已知或怀疑对人类或其他非哺乳动物有毒或致敏的物质将存在于制造过程的任何阶段,就必须提交数据证明物质不存在于制剂产品或虽然存在,但量小到不会造成任何危害?C.人类或动物病原体?人类或其他非靶标动物病原体如志贺菌?沙门氏菌和弧菌,不能在原药级别的有效成分中以危险水平存在?如果生产方法能够支持人类或动物病原体生长,每个生产批次必须检测他们的存在?每个母药或授权产品的登记申请,应该包含对配方前产品中所有可能以潜在危害水平存在的人类或动物病原体的分析?登记申请应建议从产品中检测和/或消除这些成分的方法?D.有害污染物检测?应提出用于控制产品中检测到的任何有害污染的方法?丢弃被污染的生产批次或处理制剂是可被同等接受的控制污染微生物的方法?2.1.5 样品分析
     除血清定量或其他适合微生物农药的试验可能代替化学分析外,EPA试验准则830.1800中关于样品分析的方法应该适用于微生物农药?根据生物体的特性?制造工艺,和已知或潜在的产生毒素或引起其他EPA关注的残留的能力,EPA应接受放弃分析到百分之0.1的要求?2.1.6 限量确定
     每个登记必须由一个成分限量认证支持?参考试验准则830.1750和830.1800关于限量认证和分析方法来核实确定限量?微生物农药和污染物的限量应表示为:可采用生物?遗传?生化?血清学或其他适当试验确定的单位重量或体积中的微生物农药单位?可使用生物?遗传?生化?血清学或其他适当试验确定的单位重量/体积的国际效价?产品重量百分比?注意可能需要两种或两种以上的方法来验证微生物农药和任何微生物杂质的确定限量?计数板或传染性试验对于定量可能是必要的,且允许初步鉴定?抗生素抗性的生物测定可能消除一些污染及提供额外的识别支持?在某些情况下,特别是对基因改变的微生物农药而言,绝对的识别只能通过采用一个或多个不同的免疫学方法或分子探针方法来实现?2.2 限量要求豁免1960年,美国食品和药品管理局建立了微生物BtBerliner活孢子残留限量要求豁免,该豁免在1971年EPA成立后再次发表?40CFR180.1011描述了最新的,对于微生物杀虫剂BtBerliner在蜂蜜和蜂巢,及根据良好农业操作规范在其他所有初级农产品生长期或收获后使用的残留限量要求豁免?豁免的微生物杀虫剂应:真实可靠的BtBerliner菌株,符合《伯杰细菌鉴定手册》第八版描述的Bt形态和生化特征?BtBerliner孢子制剂应当由纯培养发酵程序产生,且在生产中有足够控制措施来检测与亲本菌株特征相比或其他微生物污染的任何变化?每批孢子制剂,在加人其他材料之前,需要将至少100万个活的微生物或孢子经皮注射到5个体重在17-23g的试验小鼠中,注射后观察7天,应该没有试验动物感染或损伤的证据?当进行果蝇幼虫毒性试验测试时,孢子制剂应无Btp_外毒素?
     40CFR180.1011中限量豁免的具体语言并不反映当前Bt分类名称?这项豁免包括设计用于防止有效成分特征变化,其他微生物污染,和/或存在可检测水平的文件中?作为重登记项目的一部分,EPA对Bt进行了完整的评审?1988年EPA出版了“包含Bt作为有效成分的农药产品重新登记指南”,这就是俗称的Bt登记标准?登记标准要求提交每个Bt有效成分表征数据,使EPA能将具有相似特征的登记菌株重新分组?此外,也需要提交包括产品分析?非靶标生物,环境行为和残留分析等数据,以支持在登记标准中列出的产品用途?应登记者要求,EPA可能允许用已登记Bt有效成分的毒理和生态影响数据来支持新Bt菌株的登记?数据共享应该以不同菌株8-内毒素和其他有助于特定Bt菌株杀虫活性的有毒/协同组件的相似度为基础?如果该菌株与登记菌株的记录特征相比风险评估结论足够好,可以允许新?旧菌株某些数量上有意或无意的遗传变异?3.1 产品鉴别Bt登记标准要求提交9种表征数据,其中的五种数据子集对区分不同的菌株有用:生化和营养特征?生化和营养特征对将Bt与相似杆菌,如蜡状芽孢杆菌,炭疽芽胞杆菌相区分是有用的;且对区分密切联系的同种细菌不同亚种间变异也是有用的?将要划分在Bt的新分离菌,必须是革兰氏阳性需氧或兼性厌氧的杆状细菌,含有结晶杀虫蛋白?抗生素敏感性?Bt菌株之间观察到的不同抗生素敏感性差异很小,然而这些测试是廉价的,且在区分其它Bt菌株方面可能是有用的?此信息也有助于从环境或临床样品中分离这些菌株?宿主范围谱?历史上看,Bt亚种已经利用它们对鱗翅目?直翅目?双翅目和鞘翅目等四种昆虫的杀虫活性进行了区分?例如,Bt库斯塔克亚种对鳞翅目昆虫表现出强劲的活性,对鞘翅目?直翅目昆虫活力有限;Bt以色列亚种菌株展现出对双翅目昆虫活性,对鳞翅目和鞘翅目活力有限;Bt鲇泽亚种菌株对鞘翅目种类昆虫展示出一些活性,但是对鳞翅目活性更高;Bt拟布甲亚种仅对鞘翅目昆虫有活性?P-外毒素的活力?Bt菌株也许能产生一种热稳定的P-外毒素,称作苏云金素?P-外毒素的存在可通过高效液相色谱法或蝇幼虫生物测定评估?腹腔内试验?小鼠腹腔内注射试验作为一种质量控制措施,被用来证明原药对哺乳动物无毒?菌株历史?杀虫毒素?质粒概况?晶体蛋白的描述等其他产品标识数据?虽然这些产品标识数据缺乏区分Bt菌株的有用信息,在登记中不再做要求,但鉴定每个菌株的S内毒素将会对这些产品抗性管理产生积极作用?3.2 非目标成分的形成探讨Bt生产发酵过程可能存在三类不良污染物或毒素?一是某些Bt菌株能自然产生P-外毒素,二是由于发酵液中存在蜡状芽孢杆菌或炭疽芽孢杆菌外而产生的外毒素?有数据表明,因为发酵过程不可预知,通过测试实验室培养的活性成分来检测不良毒素的存在不可靠?因此,EPA要求登记者对每个产品每个批次的污染物,如人类病原体或不良毒素的存在进行测试,充分减少对人类的潜在危害,任何含有不能保证污染物水平安全的生产批次都必须被丢弃?三是可能在发酵过程中形成的不耐热外毒素?1988年以来,EPA已确定对水蚤有毒的热不稳定外毒素是一个值得关注的新问题?虽然EPA没有表明是否在当前产品批次系列测试中检测该毒素,但作为热不稳定外毒素水平产生的指标,每个新的制造工艺必须标准化,且通过大型蚤试验证明不含不耐热外毒素,这将确保不耐热肠毒素水平不会超过EPA在风险评估中使用的水平?
     
3.3 健康风险评估
     
3.3.1 毒性评估3.3.1.1 急性毒性
     迄今为止,还没有任何传染性/致病性研究证明Bt有哺乳动物健康效应?所有提交给EPA的毒理学数据都没有任何关于各种Bt菌株显著危害人体健康的报道?因此,只要产品鉴别和生产工艺测试数据表明菌株与哺乳动物毒性不相关,40CFR第158部分通常要求的传染性?致病性研究在未来将被省略?3.3.1.2 产生蜡状芽孢杆菌肠毒素的能力
     EPA意识到研究结果表明登记的Bt产品可能产生通常与蜡状芽孢杆菌相关的腹泻肠毒素?比较商业Bt菌株与临床分离的蜡状芽孢杆菌,所有测试的商业产品均能够产生腹泻肠毒素,但产生腹泻肠毒素水平非常低?并且EPA没有有效证据对Bt杀虫剂的实际使用情况与摄人食物后的腹泻事件建立联系?EPA相信目前Bt的使用不太可能导致在未适当存储处理的食物中微生物毒素引发的腹泻流行?3.3.1.3 对免疫和内分泌系统的效应
     目前没有已知的Bt毒素或代谢产物被确定为内分泌干扰物或免疫毒素?因此,预期Bt不会对内分泌或免疫系统造成不利影响?3.3.2 膳食?职业?居民暴露和风险表征
     Bt的使用方式可能导致未加工农产品上残留细菌孢子的膳食暴露?然而,由于缺少任何毒理学关注,消费处理过的商品预计不会对一般人群和婴幼儿产生风险?由于无哺乳动物毒性,Bt职业暴露风险非常小?目前无Bt产品登记在室内住宅?学校或托儿所使用,且Bt被用于农药已经大约50年,没有任何已知的不良影响,故居民暴露风险可以忽略不计?3.3.3 饮用水暴露和风险表征
     Bt进人地下水或其它引用水源的可能性非常小,且不能在水生环境中繁殖,饮用水暴露可以忽略不计?3.4 环境风险评估3.4.1 毒性评估为支持重登记而提交的试验结果未见对鸟类?淡水鱼?河口和海洋动物的毒性或致病性;对水蚤中等毒至高毒,但不是由S-内毒素引起的?3.4.2 暴露和风险表征3.4.2.1 非靶标陆生动物的暴露和风险由于Bt孢子和晶体相对短的杀虫半衰期,对非靶标野生动物的暴露和后续风险限制于施药后立即发生?只要适当控制生产工艺,防止外毒素产生的非靶标效应,按标签使用登记Bt产品,对非靶标有益昆虫?野生哺乳动物和鸟类的风险预计将极少甚至不存在?
     
3.4.2.2 对非靶标水生动物的暴露和风险
     由于Bt制剂主要在陆地上施药,预计不会在水生环境中出现极高水平?只要适当控制生产过程,防止外毒素产生非靶效应,按标签使用登记Bt产品,对淡水鱼?淡水无脊椎动物?河口和海洋动物预计不存在不可接受的风险和危害?3.4.2.3 濒危物种
     基于毒性和暴露数据,对濒临灭绝的哺乳动物?鸟类?植物和非昆虫水生物种不会有“可能影响”的情况出现?所有濒危昆虫物种对BtS-内毒素敏感,如果暴露可能有不利影响?3.4.2.4 水资源
     Bt在世界各地的土壤中自然发生,Bt芽胞和晶体的持续时间较短,Bt制剂应用不会增加土壤中Bt的水平?与所有土壤微生物相似,Bt不通过土壤渗透,存在限于表层10英寸的土壤中,因此无需关注地下水?饮用水污染?3.5 风险管理和重登记决定EPA于1998年发布了涉及四个Bt亚种的RED?只要采用批准的生产工艺减少或消除某些有毒非目标成分的意外产生,Bt的使用不会对人类和环境造成不可接受的影响,含有Bt作为活性成分的产品有资格重登记?EPA还表示,为减轻这些毒素对公众和非靶标物种潜在的毒性,要继续进行最初在限量豁免中要求的生产批次质量控制试验,且要求重新评估和标准化每个登记原药的生产程序?相关要求也在限量豁免和40CFR158中伟德国际官网网址提出?RED还讨论了在产品重登记中需要执行的风险减少措施?所有含Bt有效成分产品的重新评估已于2008年丨1月26日完成?4 再评价项目1996年美国《食品质量保护法》授权EPA开展再评价项目,每15年对每个登记农药进行周期性的再评价,目的是确认随着风险评估能力的发展和政策及实践的改变,所有登记农药继续符合法规标准,市场上的产品仍然能够被安全的使用?2011年9月30日,EPA启动了Bt再评价项目,目前包括21种Bt有效成分?Bt再评价是一个复杂的项目,不仅因为Bt菌株数量很大,每个都有自己的数据集;且在再评价期间,EPA将对以往分类在亚种通用电脑编码下的菌株编码进行修改,使每个菌株都有其特定的电脑编码?4.1 项目初步工作计划在PWP发布之日,EPA已完成对Bt数据库的初步审查,确定了一些数据空白?例如,大量菌株未能满足“在国家认可的菌种保存中心储藏样品”的产品分析资料要求,因为许多Bt产品是微生物农药资料要求修订之前登记的?除了全面审查Bt记录,EPA在PWP中提出以下预期数据需求和风险关注:4.1.1 风险评估数据综合考虑微生物分析技术和微生物学进展,审查限量豁免,确定其是否需要更新或修改?另外,目前的豁免是广泛的,只考虑了在属
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